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蛋白過鎳柱純化的原理：Ni-NTA 純化介質(zhì)純化帶有 His6-Tag 的融合蛋白是目前蛋白純化中zui常使用的一種方法。Ni 柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有 HIs(組蛋白) 標(biāo)簽的堿性蛋白蛋白結(jié)合，組蛋白標(biāo)簽一般是 6 個組氨酸 (堿性氨基酸)。在蛋白上樣后，帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白特異性結(jié)合到柱子里，其他的雜蛋白流出。Ni 柱中的氯化鎳或者硫酸鎳也可以與咪唑結(jié)合，采用咪唑洗脫，咪唑競爭性結(jié)合到硫酸鎳上，目的蛋白就被洗脫了，這時候收集穿出液，里面就是目的蛋白，然后透析掉咪唑即可。 上樣，清洗，洗脫，基本三個步驟就結(jié)束了。
Ni-NTA 常見問題及建議
1. His 標(biāo)簽蛋白沒有與柱結(jié)合：
a. 可能原因：超聲的功率不對 ( 太大，蛋白炭化，太小，蛋白沒有釋放)。
解決方法：改變超聲功率，并在超聲前加入溶菌酶。
b. 可能原因：樣品或者是結(jié)合緩沖液不正確。
解決方法：檢測 pH 及樣品和結(jié)合緩沖液的組成份。確保在溶液中鰲合劑或強(qiáng)還原劑的濃度及咪唑的濃度不是太高。
c. 可能原因：組氨酸標(biāo)簽暴露不*。
解決方法：在變性條件下 ( 用 4-8 M 脲，或 4-6 M 鹽酸胍) 進(jìn)行純化。
d. 可能原因：His 標(biāo)簽丟失。
解決方法 1：WB 檢查 His 是否表達(dá)，上游構(gòu)建，改變 His-tag 的位置 (C- 端或 N- 端)，必要時增加 His 個數(shù)。
解決方法 2：孵育的時間不夠，降低流速和增加孵育的時間。
解決方法 3：改變螯合的金屬離子，尋找到*的結(jié)合金屬離子。
Ni2+ 通常是從宿主細(xì)胞蛋白中純化大多數(shù) 6×His 標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)的選金屬離子。也是一般zui常用的離子。蛋白和金屬離子之間的結(jié)合強(qiáng)度受幾種因素影響，包括長度、位置、親和標(biāo)記在蛋白的暴露程度、所用離子的類型、以及緩沖液的 pH，因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進(jìn)行純化而不用 Ni2+。
2. His 標(biāo)簽蛋白沒有被洗脫下來：
a. 可能原因：洗脫條件太溫和 （組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)仍然結(jié)合在柱上，結(jié)合力較強(qiáng)）。
解決方法：增加咪唑的梯度洗脫或降低 pH 來找出*的洗脫條件。
b. 可能原因：降低 pH 的方法洗脫的，若 pH 低于 3.5，會導(dǎo)致鎳離子脫落。
解決方法：改變洗脫辦法，咪唑競爭性洗脫。
c. 可能原因：蛋白已沉淀在柱上。
解決方法： 減少上樣量，或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變 NaCl 的濃度，或在變性條件 ( 去折疊) 下洗脫 ( 用 4～8 M 脲，或 4～6 M 鹽酸胍)。
d. 可能原因：非特異性疏水或其他相互反應(yīng)。
解決方法：加非離子去污劑到洗脫緩沖液 (如：2% Triton X-100) 或增加 NaCl 的濃度。
3. His 標(biāo)簽蛋白洗脫后雜帶較多
a. 可能原因：蛋白酶部分降解了標(biāo)簽蛋白。
解決方法：添加蛋白酶抑制劑。
b. 可能原因：雜質(zhì)對鎳離子有更高的親和性。
解決方法 1：咪唑濃度必須優(yōu)化，以確保高純度 ( 宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的低結(jié)合) 和高產(chǎn)率 ( 組氨酸標(biāo)記的目標(biāo)蛋白質(zhì)的強(qiáng)結(jié)合) 之間的*平衡。分步或者線性洗脫摸索出*的咪唑結(jié)合和清洗濃度; 在樣品中加入與結(jié)合緩沖液同樣濃度的咪唑; 咪唑的梯度不大 (20 個或更多的柱床體積)，可能分離出有相似結(jié)合強(qiáng)度的蛋白。
解決方法 2：篩選的緩沖液條件，NaCl 濃度，pH 的范圍都需要進(jìn)行篩選。對于單一目標(biāo)蛋白在進(jìn)行緩沖液篩選時，將緩沖液、鹽、甘油和還原劑設(shè)計成不同的混合配方來進(jìn)行優(yōu)化。
解決方法 3：若以上優(yōu)化的條件都不能去除雜質(zhì)蛋白，需要考慮多步純化的思路，如利用 Strep 標(biāo)簽進(jìn)行兩步純化或采用 Subtractive method 進(jìn)行純化。
c. 可能原因：雜質(zhì)和標(biāo)簽蛋白結(jié)合在一起。
解決方法：在超聲破碎細(xì)胞之前加入去垢劑或者還原劑; 增加去垢劑的濃度 ( 2% Triton X-100 or 2% Tween 20); 或者在 Wash buffer 中增加甘油的濃度 (50%) 減少非特異性的相互反應(yīng); 考慮增加咪唑的濃度或者改變金屬離子。
d. 可能原因：洗滌不充分。
解決方法：增加洗滌的次數(shù)，使洗滌充分。
4. 使用幾次后 Ni 柱載量下降，掛柱效率低，如何處理？
可能原因：逐漸積累沉淀，變性或非特異結(jié)合的蛋白占據(jù)了有效的結(jié)合位點，而通過洗脫液無法*清洗所致。
較溫和的清洗方法： 用 2 倍柱體積的 6M 鹽酸胍或 8M 尿素洗滌，然后用 5 倍體積的緩沖液洗滌，以去除沉淀或變性物質(zhì)。用 2 倍柱體積的 1% Triton X-100 洗滌，然后用 5 倍柱體積的緩沖液洗滌，以去除疏水結(jié)合的物質(zhì)。若改變不明顯，可選擇強(qiáng)烈清洗方式。
強(qiáng)烈清洗方式： 首先用 5－10 倍柱體積的脫鎳緩沖液（20 mM 磷酸鈉， 0.5 M NaCl，50 mM EDTA， pH 7.4）洗滌，迚行脫鎳操作，然后用 5～10 倍柱體積的平衡緩沖液沖洗，zui后用 5－10 倍柱體積的雙蒸水沖洗；隨后進(jìn)行清洗操作，去除離子型雜蛋白，可以用 5 倍柱體積的 1.5 M NaCl 溶液，然后 10 倍柱體積的雙蒸水沖洗；去除沉淀或變性蛋白，可以用 1M 氫氧化鈉溶液，結(jié)合 1～2 小時，然后用 10 倍柱體積的平衡緩沖液和 10 倍柱體積的雙蒸水迚行沖洗；去除疏水蛋白或者脂蛋白，可以用 5－10 倍柱體積的 30% 異丙醇溶液清洗，然后 10 倍柱體積的雙蒸水洗滌；zui后進(jìn)行生鎳操作，用 0.1M 硫酸鎳上柱，隨后 5 倍柱體積的雙蒸水和平衡緩沖液迚行洗滌，如需保存，保存在 20% 乙醇溶液。
5. 鎳柱使用中出現(xiàn)棕色是怎么回事?
可能原因：緩沖液中 DTT 的影響， DTT 會對鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響, 在堿性的緩沖液條件下，鎳離子會被 DTT 還原生成棕色的沉淀，所以要盡量避免 DTT 的參與。
因此，若您的樣品中含有 DTT，在上樣之前, 我們推薦采用不含還原性試劑的空白運行來除去任何較弱結(jié)合的鎳離子；空白運行方法（使用不含還原劑的平衡液和洗脫液）1）5 倍柱體積的雙蒸水洗柱 ；2）5 倍柱體積的平衡液洗柱；3）5 倍柱體積的洗脫液洗柱；4）10 倍柱體積的平衡液平衡。當(dāng)不使用時，勿將 Ni Sepharose 6 Fast Flow 保存于含還原性試劑的緩沖液中。
6. 填料是否可以重復(fù)使用？可以使用多少次?
如果維護(hù)的好的話, 填料在其效期之內(nèi)可以一直重復(fù)使用。如果每次都是純化同樣的蛋白就沒有必要剝離掉鎳離子重新掛鎳，一般經(jīng)過 5-7 次純化之后可以進(jìn)行脫鎳和再生鎳的操作。如果柱子反壓高了，填料需要做*的在位清洗 CIP，在清洗之前，為了避免金屬鹽的沉淀，需要剝離掉鎳離子，然后再重新掛鎳，清洗后保存在 20％ 的乙醇中。
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